Рабочая гипотеза

Рабочая гипотеза

Теперь уместно будет изложить в общих чертах мою гипотезу. Она должна была ответить на три вопроса, оставшихся без внимания ученых:

1) каким образом происходит необходимая смена ферментов в покоящихся клетках высших организмов?

2) используется ли как-нибудь избыточность генетического кода?

3) какую роль играют минорные нуклеотиды в тРНК?

Первый вопрос нуждается в пояснении. Описанный ранее прямой путь передачи информации от гена в ДНК через информационную РНК к рибосоме был хорошо изучен у бактерий. Напомню, что ДНК бактерии относительно свободно умещается в ее клетке, не образуя многократно скрученных, тугих структур, входящих в состав хромосом высших животных. Изменение состава питательных веществ, попадающих извне в любую клетку, или изменение ее состояния в ходе развития и специализации требует быстрой смены ферментов, работающих в ее цитоплазме. У бактерий это происходит просто. Приходящий извне химический «сигнал» запускает считывание РНК-полимеразой легкодоступного нужного гена. Информационная РНК приносит копию гена к рибосоме. Немедленно начинается синтез нужного фермента, позволяющего усвоить принесенное кровью новое питательное вещество. Операция повторяется до тех пор, пока в клетке не окажется достаточное количество этого фермента. Если в силу смены питания он и соответствующая ему информационная РНК оказываются ненужными, они разрушаются другими ферментами, специально существующими для этой цели в клетке. На их место поступают другие, нужные в новых условиях информационные РНК и ферменты.

Такая же смена должна происходить в клетках высших животных, хотя бы по причине изменения потребляемой пищи. Но добираться каждый раз до глубоко спрятанного в плотной упаковке ДНК нужного гена у этих организмов слишком трудно.

Отсюда первое предположение моей гипотезы состояло в том, что в нормальных условиях существования клеток высшего организма, в длительном покое, все могущие потребоваться информационные РНК уже находятся в цитоплазме. Они синтезируются и выходят в нее из ядра во время деления клетки, когда структура ДНК расслаблена. В цитоплазме эти информационные РНК хранятся до момента их использования защищенные специальными белками от ферментов-разрушителей («чистильщиков»). Подобные структуры, названные «информосомами», были обнаружены в начале 70-х годов. Для решения задачи временной наработки большого количества какой-то одной из информационных РНК я вынужден был предположить возможность копирования информационных РНК, то есть синтеза РНК по матрице РНК. (Такой вид матричного синтеза обнаружен совсем недавно.)

Что касается второго вопроса — возможности использования избыточности генетического кода, то она может послужить клетке высшего организма для регулирования относительной скорости синтеза различных белков. На уровне «прочтения» в рибосоме последовательности нуклеотидов, доставленной информационной РНК.

Дело в том, что избыточность генетического кода оказалась далеко не равномерной. Когда я писал ранее, что для кодирования 20 аминокислот остается 61 кодон, можно было предположить, что, как правило, каждой аминокислоте соответствуют три кодона. Но это не так. Три аминокислоты «имеют» по 6 кодонов каждая. Пяти другим аминокислотам соответствует по 4 кодона. На долю остальных 12 аминокислот остается 23 кодона. И все они «разобраны», то есть кодируют аминокислоты — в большинстве случаев по два кодона на каждую.

Кстати, это обозначает и избыточность числа различных тРНК. Их должно быть как минимум столько же, сколько «активных» кодонов, то есть 61. Транспортные РНК, приносящие одну и ту же аминокислоту к разным кодонам называют «изоакцепторными тРНК» для этой аминокислоты. (Они все присоединяют к своему концу — «акцептируют» одну и ту же аминокислоту.) Прошу читателя запомнить смысл этого названия изоакцепторные тРНК. В дальнейшем мы часто будем иметь с ними дело.

Теперь к существу гипотезы. Предположим, к примеру, что аминокислота «серин», у которой 6 различных кодонов, в информационной РНК, предназначенной для синтеза некоего белка А, закодирована одним из этих шести кодонов (присвоим ему № 1). Если в цитоплазме клетки отсутствует «зрелая» изоакцепторная тРНК серина, способная «узнать» этот кодон (или ее очень мало), то синтез белка А окажется невозможен (или чрезвычайно замедлится). Наш «злополучный» кодон № 1 будет играть роль «модуляторного кодона», постулированного Эймсом и Хартманом. Во всех прочих белках серин может быть закодирован любым из остальных пяти его кодонов. И если для них имеются в достаточном количестве зрелые изоакценпторные тРНК, то все эти белки будут синтезироваться с нормальной скоростью. Впрочем, поскольку у серина целых 6 кодонов, замедление может в разной степени коснуться нескольких белков — получается целая гамма скоростей синтеза серин-содержащих белков, управляемая пропорцией наличествующих в клетке дееспособных («зрелых») изоакцепторных тРНК серина.

Те же «игры» могут разыгрываться для белков, использующих другие избыточные кодоны, для других аминокислот.

Для завершения рабочей гипотезы (и ответа на 3-й вопрос) остается предположить, что «зрелость», дееспособность любой тРНК определяется полнотой ее «миноризации», полнотой набора «положенных ей» миноров. Мы знаем, что первоначально тРНК синтезируется как цепочка нормальных нуклеотидов. Миноризация происходит потом, в цитоплазме, благодаря активности метилаз и других модифицирующих ферментов. Это означает, что управление скоростями биосинтеза ферментов и прочих белков переносится на уровень соотношения активностей различных метилаз и других модификаторов. (Число их должно отвечать числу разных тРНК и необходимому количеству модификаций в каждой из них.) Но активизация или угнетение активности различных ферментов может зависеть от веществ, поступающих в клетку извне, из крови. Например, необходимых низкомолекулярных «помощников» ферментов. Иногда эту роль играют ионы определенных металлов или простые молекулы некоторых витаминов.

Подтверждение этой гипотезы открыло бы колоссальные новые перспективы для медицины, поскольку многие заболевания связаны с нарушениями пропорций биосинтеза белков в клетках, определяющих функционирование важных для жизнеспособности органов. А иногда причиной болезни может служить отсутствие синтеза некоего белка или наоборот — синтез белка вредного. Гипотеза дает надежду на возможность управления всеми этими отклонениями от нормы извне, через кровь или лимфу. Притом не чисто эмпирически, а сознательно: воздействуя на активность модифицирующих тРНК ферментов. (Разумеется, для этого они должны быть выделены и изучены.)

Но каким образом полнота «миноризации» молекулы тРНК может влиять на ее дееспособность? Ответ, по-видимому, надо искать в механизме взаимодействия несущей аминокислоту тРНК с рибосомой. Уже упоминалось, что молекулы тРНК складываются и приобретают некую пространственную конфигурацию. В ее образовании должны играть свою роль миноры. Сама же эта конфигурация может быть необходима для того, чтобы занять нужную позицию на рибосоме. Из этого предположения неявно вытекает еще и возможность того, что сама рибосома «дышит» — слегка меняет конфигурацию «места узнавания» в зависимости от приходящего в него кодона. Недаром же рибосома представляет столь сложное образование (в нее входит несколько десятков белков и специальные «рибосомные РНК»).

Вот такова гипотеза. Но как приступить к поиску ее подтверждения?

В первую очередь надо было найти объект исследования, который можно изучать в двух физиологически различных состояниях с тем, чтобы сравнить наборы изоакцепторных тРНК в каждом из них. Затем можно было бы провести реакцию синтеза белков in vitro, совмещая в ней информационную РНК и ферментную систему из одного состояния с набором всех тРНК из другого состояния. Проанализировать весь спектр белков, синтезируемых в такой гетерогенной системе, и сравнить его с наборами белков, синтезируемых в гомогенных системах, когда информационные РНК, ферменты и тРНК были бы взяты из одного и того же состояния. Быть может, таким образом удалось бы показать, что набор синтезируемых белков действительно определяется набором дееспособных тРНК.

К счастью, такой во всех отношениях удобной объект уже существовал и физиологически был хорошо изучен. Его за несколько лет до того отыскал заведующий одной из лабораторий Института биологии развития, молодой, но очень талантливый исследователь Саша Нейфах. Я был с ним хорошо знаком.

Этим объектом служила маленькая рыбка вьюн, похожая на очень короткого (не более 30 см в длину) угря. Вьюны водятся в нашей средней полосе, особенно в старицах рек и в других неглубоких и стоячих водоемах. Их Саше пару раз в месяц привозил в двух больших бидонах (самцы и самки отдельно) очень колоритный, высокий и жилистый старик. Он знал. наверное, все места в центральной России, где водится вьюн. Держал их в секрете. Теперь и я стал его клиентом. В оплату за труды старика зачислили в Институт лаборантом. Вьюны предпочитают температуру не выше 20°С. Я их хранил в нескольких больших пластмассовых баках для белья, штук по 50 в каждом, в «холодной комнате» при +4°С. Там они благополучно дремали до очередного опыта. Кормить их не было нужды — только ежедневно менять воду. Отработанная Нейфахом процедура получения оплодотворенной икры была достаточно простой. Самкам вкалывали половой гормон хориогонин и через 39 часов пребывания при температуре +17°С легко выдавливали из них икру в плоскую и неглубокую стеклянную чашку с небольшим количеством воды. Заблаговременно, вспоров брюшко у самцов, извлекали семенники, нарезали их на мелкие кусочки, которые раздавливали в ступке с несколькими миллилитрами слабого солевого раствора. В чашку с икрой через смоченную водой марлю выдавливали экстракт из семенников. При осторожном перемешивании происходило оплодотворение — икра явно набухала... Далее Саша следил за ранним развитием зародышей в тех же чашках, помещая их в термостат при температуре 21,5°С. Время от времени чашки покачивали для улучшения аэрации. Уже через 2 часа в бинокулярную лупу можно было видеть, как на поверхности икринки появлялся первый «пузырек». Затем он делился надвое, потом еще деление и так далее. На икринке нарастает «шапочка» (бластодерма). Это уже зародыш. В течение первых 20 часов он проходит ранние стадии развития (морула — бластула — гаструла). На глаз это заметно как увеличение бластодермы и уменьшение размеров образующих ее клеток. Считается, что через 20 часов в зародыше начинаются процессы «органогенеза». Я не пытался вникнуть в тонкости физиологической эволюции зародыша. Мне было достаточно уверенности в том, что по мере его развития в клетках бластодермы начинают синтезироваться новые, характерные для каждой последующей стадии белки. Эту уверенность разделял и Нейфих. Открывалась возможность обнаруживать изменения белкового состава и наборов тРНК в зародышах с разных стадий развития.

Не устраивали меня только масштабы работы Нейфаха. Ему для наблюдений достаточно было располагать икрой из трех-четырех рыб. А мне для осуществления последующих операций фракционирования белков и тРНК надо было запускать в процесс одновременного развития икру из, по меньшей мере, полусотни рыб. Выращивание зародышей на чашках для этого не годилось. Из нижней половины разрезанной стеклодувом 20-литровой бутылки от реактивов, настольного малогабаритного вентилятора, жидкостного термостата и некоторых вспомогательных устройств мне удалось соорудить прибор, в котором благодаря непрерывной циркуляции 10 литров взвеси икринок в воде происходило нормальное развитие зародышей. (Как ни странно, повторить эту конструкцию не удалось никому, даже Нейфаху — у них икра не росла.)

Не буду описывать процедуры отделения и очистки бластодерм любой стадии развития от «желтка» — самой икринки с ее запасом питательных веществ. Все эти процедуры были отработаны Нейфахом. Важно то, что в результате удавалось получить (в зависимости от стадии развития) от 2 до 5 грамм зародышевого материала. Этого было достаточно для проведения всех многочисленных и тонких операций по вскрытию клеток зародыша, извлечению из них нужных фракций, постановке опытов in vitro и последующего анализа результатов этих опытов.

Ограничусь замечанием, что отработка всех методик и проведение самих экспериментов потребовали от меня и моих двух лаборанток напряженной работы в течение девяти лет. После чего постараюсь вкратце изложить полученные результаты, разбив всю работу на три этапа.

1-й этап. Обследование метилаз вьюна

Поскольку методика сопоставления активностей метилаз из разных источников была уже отработана, решено было провести сравнительную оценку активностей метилаз из разных органов вьюна и его зародышей на 10-часовой и 30-часовой стадиях развития. Соотношения этих активностей оказались бы полезными на заключительной стадии исследования роли тРНК в регулировании биосинтеза белков.

Полученные результаты обнаружили, что соотношения активностей соответствующих метилаз для печени, сердца и мозга вьюна, а также его зародышей сильно различаются между собой. Повторенный в эти же дни анализ распределения активностей для печени крысы оказался совсем иным, чем для печени вьюна.

Методически опыты ставились так же, как описано ранее: субъектом метилирования служила суммарная тРНК из «дефицитных» по синтезу метильной группы бактерий E.coli K12W6 (CH3^-). Радиоактивный метил включался за счет того же ¹⁴С-SAM.

В другой серии опытов прослеживали динамику изменения активности метилаз в зародышах вьюна в зависимости от времени их развития. Сопоставляли стадии: 4,5; 7; 12; 20 и 27 часов роста. Различия в распределении активностей метилаз были не столь резкими, как для разных тканей взрослого вьюна, но заметные. При этом для некоторых метилаз можно было усмотреть определенную постепенность изменения активности от одной стадии развития зародыша к другой.

Обнаружение отличия в распределении активностей разных метилаз из тканей одного и того же животного и тем более, его зародышей на разных стадиях развития свидетельствовало в пользу предложенной гипотезы, но никак еще не доказывало ее правильность.

Этот этап занял тоже около двух лет: 73-й и 74-й годы.

Любезный читатель, здесь я еще раз позволю себе небольшое отклонение от темы. Неумолимая хронология заставляет меня отложить на время описание наших исследований и отдать дань событию, случившемуся в нашей лаборатории в том же 74-м году. Событие это повлияло не только на мою собственную судьбу, но и на судьбу всего нашего Института.

В один прекрасный день Александр Александрович Баев сообщил нам, что вскоре в лаборатории появится новый сотрудник, Костя Скрябин, сын академика-секретаря президиума Академии наук (и, как я уже упоминал, близкого друга Баева). Эта новость была с тревогой воспринята почти всеми сотрудниками, еще остававшимися в лаборатории. К «барскому сыночку» они заранее питали недоверие и неприязнь. Мне это казалось несправедливым. «Костя не виноват, что родился в столь высокопоставленной семье, — убеждал я моих коллег. — Быть может, он отличный парень. Давайте примем его дружески, а там посмотрим, что он за птица».

Но вот он появился. Высокий, статный, быстрый в движениях и горячий в споре. Красивый, с еще очень юным лицом, на котором довольно нелепо выглядели густые, как у его отца, усы. Приветливый. Хотя что-то в этой приветливости и в выражении лица было (или казалось) немного высокомерным и нагловатым. Явно умный. Он только что защитил кандидатскую диссертацию и потому пригласил нас всех к себе домой, в огромную академическую квартиру, отметить это событие.

Под моим нажимом подготовили некий приветственный «капустник», шутливо обыгравший тему восхождения новой звезды на научном горизонте. Потом прилично выпили (старшее поколение деликатно отсутствовало), и первоначальная натянутость сменилась шумным и вполне дружелюбным застольем.

Однако в первые же недели пребывания в лаборатории «восхождение звезды» пошло с такой скоростью, что мы, как говорится, только рты разинули. Александр Александрович передал в распоряжение Кости три лабораторных «модуля», в которых ранее работала его группа. Немедленно в них началось переоборудование. Заграничные химические столы сплошь из дюраля, покрытого каким-то ко всему на свете устойчивым лаком, со множеством ящичков, легко выкатывающихся на колесиках, заменили наши массивные деревянные, покрытые линолеумом «гробы». Сменили свое национальное происхождение даже вытяжные шкафы. Потом появились набранные Костей пятеро сотрудников. Все — молодые, энергичные ребята. Трое — иногородние аспиранты. Затем начали поступать приборы. Вне каких-либо институтских заявок и лимитов. Валюта для их приобретения — «целевым назначением». Стало понятно, почему Баев в течение трех лет после избрания академиком-секретарем Отделения не оставлял заведывания лабораторией (безвозмездно).

За рубежом бурно развивалась генная инженерия. Баев и юный Скрябин были одними из первых в СССР, кто ринулся в этот поток. Конечно, они могли бы работать в Пущине, в институте Скрябина старшего, но Костю это, видимо, не устраивало. Карьеру надо было делать в Москве, на виду у руководства Академии. Поработав с полгода руками и «запустив в дело» своих сотрудников, Костя отправился на годичную стажировку в США (за последующие четыре года он побывал там раз пять или шесть). После его возвращения Баев стал гораздо чаще бывать в лаборатории, но интересовался только делами группы Скрябина.

Костя Скрябин оказался одним из самых ярких представителей нового поколения советских ученых. Его интересовало не раскрытие тайн природы, а личный успех. И этот успех ковался энергично, без ложного стеснения. Благами отцовского и баевского покровительства этот молодой человек пользовался с очаровательной откровенностью. К нам, грешным, не принадлежавшим к научной элите, он относился с добродушным презрением.

Кстати, я только тогда, и то случайно, узнал о существовании такой «элиты». Наверное, года через три после появления Кости у нас случилось ЧП. В Финляндию на какую-то конференцию поехала группа наших сотрудников и в их числе Алик Варшавский. Едва ли не первый случай, когда рядового еврея послали за границу. Алик был очень талантливым молодым человеком, уже широко известным по своим публикациям. Руководителем делегации был назначен Юра Богданов, тоже сын академика. Из Финляндии Алик сбежал! Точнее, по предварительной с ним договоренности его выкрали американцы и доставили в США, где он тут же получил лабораторию. Для института это была большая неприятность. И вот я услышал, как Костя Скрябин со злостью бросил проходившему мимо Юре Богданову: «Наша семья с вашей больше никакого дела иметь не будет!»

Сам Костя уже не работал за химическим столом, а разъезжал по свету и вращался где-то в начальственных сферах, как главный специалист по генной инженерии. Но мальчиков своих он заставлял работать чуть ли не круглосуточно. Конечно, не даром. Им были обещаны кандидатские диссертации, жилье и московская прописка для иногородних. Вскоре была подготовлена Костина докторская диссертация. Защитил он ее блестяще. Надо сказать, что способностей этому юноше было не занимать. И эрудиции тоже. Он схватывал на лету и держал в памяти все, что видел и слышал за границей.

Так был взят старт. И хорошо просматривался вожделенный финиш. Энгельгардту было уже за 80. Без сомнения, Скрябин старший и Баев прочили Костю ему в преемники. Но сначала надо было очистить и занять место заместителя директора по науке. Эту должность уже 15 лет занимал Борис Павлович Готтих. Он проявил себя как очень неплохой администратор — дельный, спокойный, терпимый, по-немецки аккуратный. Умел улаживать конфликты, справедливо согласовывать противоречивые интересы лабораторий. Крупным ученым он стать не мог, поскольку в 30 лет взвалил на свои плечи тяжкий груз фактического руководства всей организационно-административной работой в Институте. Готтиха надо было спихнуть вопреки Энгельгардту, который его очень ценил.

Помог случай! Побег юного Варшавского «повесили» на Готтиха. Соответствующие кнопки были нажаты, и райком партии не только влепил Борису строгий выговор, но, ко всеобщему сожалению, снял его с поста заместителя директора Института.

Одновременно с ростом как на дрожжах юного Скрябина произошел полный разрыв Баева с Энгельгардтом. Бывая в Институте, Александр Александрович никогда более не заходил в кабинет Владимира Александровича, которому был обязан всей своей карьерой. Ни на одной из сотен любительских фотографий, относящихся к последнему десятилетию жизни Энгельгардта (он умер в 84-м году) нет снимка, где были бы рядом Баев и Энгельгардт. Хотя оба они, подобно путникам, вышедшим к воде после долгих странствий в пустыне, с жадностью использовали каждую возможность поехать за границу для участия в международных конференциях, симпозиумах и совещаниях. Говорили, что разрыв этот произошел еще до 74-го года, когда жена Баева «Катенька», бывшая медсестра в норильской больнице, после избрания мужа академиком-секретарем вообразила себя гранд-дамой (я не интересовался, в чем это выразилось), но была поставлена на место супругой Энгельгардта Милицей Николаевной, действительно аристократкой, получившей воспитание в Париже. А помимо этого — крупным ученым, профессором, почти в равной мере участвовавшим в открытии, принесшем мировую славу Владимиру Александровичу. Катенька не простила, а Александр Александрович был у нее под каблучком. Впрочем, за достоверность этого слуха я поручиться не могу.

Но вернусь к Косте. Место заместителя директора освободилось, однако он на него не попал. «Деда» еще рано было списывать со счетов. Временно, до утверждения президиумом Академии, он назначил своим заместителем Андрея Мирзабекова. Это был серьезный удар по планам Баева и Скрябиных. Андрей и его лаборатория работали очень успешно. Их достижения приобрели известность во всем научном мире. Мирзабеков уже давно стал доктором наук, но... все-таки был беспартийным. Костя же, естественно, был членом партии. Директор академического Института — номенклатура ЦК. То, что терпели в отношении всемирно знаменитого Энгельгардта, ЦК не мог разрешить Мирзабекову!

И вот... в один прекрасный день я с удивлением увидел, что на повестке дня очередного партсобрания стоит «прием в кандидаты КПСС А. Д. Мирзабекова». У меня с Андрюшей, несмотря на разницу в возрасте, отношения были дружеские. Я знал его как человека вполне порядочного. Встретив в коридоре, спросил: «Андрюша, зачем? Как же так?» Смутившись, он ответил: «А что делать, Лев Абрамович? Коготок увяз — всей птичке пропасть!» Вскоре его избрали членом-корреспондентом Академии и после смерти Владимира Александровича назначили директором ИМБ. Потом выбрали и академиком. Он возглавлял Институт в течение 18 лет, хотя, по существу дела, руководил (и весьма активно) главным образом своей сильно разросшейся лабораторией. Летом 2003 года Андрей неожиданно умер[4].

Костя Скрябин из ИМБ ушел, чтобы возглавить какой-то другой, не академический Институт. В конце концов его тоже избрали действительным членом Академии наук. Судя по частым появлениям на радио и экране телевизора, он теперь самый главный специалист по генной инженерии. Которая, впрочем, в связи с запрещением биологического оружия утратила свое главенствующее значение...

Но в моем отступлении я ушел очень далеко вперед. Вернемся «к родным баранам». Я прервал рассказ о наших опытах после 1-го этапа работы. Давайте двинемся дальше.

2-й этап. Выяснение различия наборов изоакцепторных тРНК на 6-часовой и 12-часовой стадиях развития зародыша вьюна

Суммарную тРНК из клеточного сока зародышей на этих стадиях выделяли разработанным нами методом. Другие порции клеточного сока из тех же самых стадий развития с помощью колоночной хроматографии освобождали от собственных тРНК и всех аминокислот. В этом соке, однако, оставались ферменты, присоединяющие различные аминокислоты к соответствующим молекулам тРНК для переноса их в рибосому. Назовем их сокращенно «синтетазами». Напомню, что в силу избыточности генетического кода для всех аминокислот существует несколько (от 2 до 6) разных, так называемых изоакцепторных тРНК, несущих одну и ту же аминокислоту, но «узнающих» различные ее кодоны в информационных РНК.

Для каждой из двух стадий развития зародыша, in vitro проводили реакцию присоединения к тРНК (в разных опытах) десяти различных аминокислот. Каждый раз в пробирке смешивали суммарную тРНК, клеточный сок, содержащий все синтетазы, но освобожденный от аминокислот и только одну из девяти выбранных аминокислот. Причем радиоактивно меченную! Инкубировали при 37°С в течение 40 минут. Присоединяясь к «своим» изоакцепторным тРНК, эта меченая аминокислота «метила» и тРНК. Так что по радиоактивностям фракций, выходящих из хроматографической колонки, можно было построить «пики» или, лучше сказать, профили этих тРНК. Аминокислоты, присоединяющиеся к тРНК из 6-часовой стадии развития зародыша, метили радиоактивным тритием (³Н). А те же аминокислоты, садящиеся на тРНК из 12-часовой стадии, были помечены радиоактивным углеродом (¹⁴С). Продукты двух реакций присоединения одной и той же аминокислоты смешивали и вносили на специально подобранную для этой цели хроматографическую колонку. Число профилей на хроматограмме указывало число активных на данной стадии развития изоакцепторных тРНК для выбранной радиоактивно меченной аминокислоты. Современный счетчик радиоактивности позволяет в любой выходящей из колонки фракции измерять независимо радиоактивности трития и ¹⁴С-углерода. Условия хроматографического разделения очевидно тождественны для обоих тРНК, взятых из разных стадий развития зародыша.

Если зародыши на двух сопоставляемых стадиях роста имеют одинаковые изоакцепторные тРНК для данной аминокислоты, то их профили, меченные разными изотопами, должны совпасть. Если же эти тРНК различаются числом или характером своей «миноризации», то профили должны разойтись.

Из девяти сопоставленных таким образом тРНК для двух стадий развития зародыша пять не обнаружили никаких различий — их профили точно совпадали. А для четырех тРНК наблюдалось явное расхождение профилей и даже различие в их числе. Что означало различие числа изоакцепторных, «работающих» тРНК на двух сопоставляемых стадиях роста. Наверное, не случайно для всех этих четырех аминокислот генетический код оказался сильно избыточным. В четверку вошли все три аминокислоты, которым соответствует по 6 кодонов, и одна, имеющая 4 кодона.

Эти результаты также свидетельствовали в пользу нашей гипотезы. Но и они еще не доказывали ее правильности.

Описанный этап длился тоже два года: 75-й и 76-й.

3-й этап. Решающий эксперимент

План был таков. Очистить от тРНК и аминокислот клеточный сок из 6-часовой стадии развития. В нем должны остаться все ферменты и информационные РНК, присутствующие на этой стадии. Далее осуществить два опыта. В первом из них к этой очищенной системе добавить полный набор 20-ти аминокислот, из которых хотя бы одна (все равно какая) была бы радиоактивно меченая, а также суммарную фракцию тРНК, очищенную из той же 6-часовой стадии развития зародыша. Провести синтез in vitro радиоактивно меченных белков (одной меченой аминокислоты для этого достаточно).

Во втором опыте проделать то же самое, но суммарную фракцию тРНК очистить из 12-часовой стадии и провести in vitro синтез радиоактивных белков в тех же условиях. В обоих случаях отобрать белковые фракции, куда войдут и новосинтезированные, радиоактивно меченные белки. Затем разделить их методом электрофореза в тождественных условиях — в параллельных «дорожках» на одной и той же пластине геля. Если во втором случае по сравнению с первым обнаружатся дополнительные белки, то это означает, что их синтез был стимулирован именно «поздним» набором тРНК. Ведь информационные РНК в обоих опытах одни и те же, взятые из 6-часовой стадии роста.

Для постановки этих опытов было необходимо, во-первых, найти и оптимизировать условия осуществления синтеза полноценных белков in vitro в описанных выше условиях. Во-вторых, освоить и оптимизировать для наших объектов метод электрофореза в геле, позволяющий разделять большое число белков. В-третьих, отработать оптимальные условия регистрации полученного разделения белков на рентгеновской пленке. Все это заняло около двух лет. Наконец, все методики были отработаны и «решающий эксперимент» поставлен и повторен. Были получены четкие, воспроизводимые картины электрофореза белков, синтезированных in vitro для двух сопоставляемых условий эксперимента, отличающихся только использованными комплектами тРНК — из 6-часовой и из 12-часовой стадий развития зародыша вьюна. На рентгеновской пленке были ясно видны две соседствующие дорожки. В каждой из них зафиксировано порядка ста полос, отвечающих отдельным радиоактивно меченным белкам.

Но... при самом тщательном визуальном сопоставлении наборов этих полос различия между ними обнаружить не удалось!! Значило ли это, что гипотезу о регуляторной роли тРНК следует отвергнуть? Нет, не значило! Новые белки могли появиться в очень малых количествах. На фоне множества «изначально необходимых» белков, синтезируемых на всех стадиях роста, их, может быть, и невозможно обнаружить. Окончательный вывод можно сделать, только убрав до электрофореза из смеси белков, синтезированных с помощью тРНК из 12-часовой стадии, все «необходимые» белки, синтезируемые уже на 6-часовой стадии роста. По-видимому, единственный путь для решения этой проблемы лежал через использование иммунохимического подхода!

В тот несчастливый день я долго размышлял, глядя на как будто одинаковые картины разделения белков из двух сопоставляемых опытов. Методами иммунохимии я не владел вовсе. Для их освоения потребовалось бы 2-3 года стажировки в соответствующей лаборатории (лучше зарубежной). Или вовлечения в нашу работу кого-нибудь из опытных иммунохимиков со стороны. То и другое требовало поддержки заведующего лабораторией или директора Института. Баеву моя работа была неинтересна, а Энгельгардт был увлечен бурно развивавшейся во всем мире генной инженерией. Между тем мне уже исполнилось 56 лет. Освоение методов иммунохимии самоучкой, по книгам, методом «проб и ошибок» заняло бы очень много времени. Я понял, что доказать мою столь многообещающую гипотезу не успею. Впервые пришла в голову мысль о нецелесообразности дальнейшего пребывания в Институте...

Для очистки совести сделал последнюю попытку. Написал большую, на десять журнальных страниц, обзорную статью. Собрал в ней все косвенные данные в пользу своей гипотезы, рассыпанные по зарубежным публикациям за последние пять лет. Включил и описанные выше, полученные нами (тоже косвенные) свидетельства. Написал, конечно, и о перспективах для медицины, которые откроются в случае надежного подтверждения гипотезы. Перевел на английский и послал во французский журнал «Biochimie» (V. 61, № 3, 1979 г.), выходящий на международном для науки, английском языке. Статью напечатали полностью, без каких-либо редакторских поправок. Получил более 500 запросов на оттиски этой статьи. Что толку? После моего отказа в 68-м году от поездки в Чехословакию (см. главу 13), дорога в заграничные лаборатории для меня была закрыта.

Русский текст статьи разослал всем академикам — вершителям судеб молекулярной биологии в нашей стране. Никто из них на нее не откликнулся. Оно и понятно — все были увлечены генной инженерией. Последнее мое прибежище в большой науке, — молекулярная биология — явно вступала на «тропу войны». В силу той же решимости не участвовать в подготовке биологического оружия.

Намерение оставить поприще научной работы созрело окончательно. В ее результат можно было зачислить только четыре неплохих обзора (из них три — на русском языке) и более практически ничего...

Невеселый итог двадцатилетней напряженной работы! Что его обусловило? Ну, во-первых, поздно начал — в 36 лет. В этом не виноват — начал одновременно с началом становления молекулярной биологии в нашей стране. Быть может, не следовало тратить добрых восемь лет на оборудование Института? Нет, следовало! Кроме меня, это сделать было некому. И моя деятельность, пусть уже всеми забытая, была бесспорным вкладом в развитие советской науки. Не следовало уступать свою первую тематику Роберту? Возможно, но в тот момент, в силу своих тогдашних нравственных принципов, я не мог поступить иначе. Быть может, надо было воспользоваться открытием медленного изотопного обмена водорода в нуклеиновых основаниях, защитить на этом кандидатскую, а потом и докторскую диссертации? Что дальше? Добиваться (быть может, в другом Институте) заведывания лабораторией, чтобы иметь в своем распоряжении команду молодых и толковых исследователей? Неплохо бы, но не люблю конкурентную борьбу за начальственное кресло. Да и не хочу занимать его в советской иерархической системе — даже в науке! Подыскать умного и порядочного «шефа» и работать в его фарватере? Это надо было делать с самого начала. Потом я стал слишком самостоятельным и вряд ли был бы удовлетворен работой в начатом за рубежом направлении, как работали все известные мне тогда «большие ученые», кроме, разве, Хесина. Но меня к нему не взяли. Нет, наверное, все сложилось правильно. Жаль только, что времени не хватило...

Когда Баев увидел, что я прекратил экспериментальную работу, он избавился от меня без лишних церемоний. Вернувшись из отпуска, я обнаружил, что мои вещи и все бумаги из рабочего стола вынесены в коридор. В комнату поселили тогдашнего сотрудника Кости Скрябина Петю Рубцова. Ему же передали и мою Полину. К счастью, Петя оказался человеком достойным и доброжелательным. С Костей его научные пути разошлись. Из Института он не ушел. Баев лабораторию оставил, и она окончательно разбилась на разрозненные группы. Полина до сих пор работает с Петей. Он к ней относится хорошо, чему я очень рад.