ГЛАВА 9 Пенициллиназа

ГЛАВА 9

Пенициллиназа

В январе 1967 года я прошел по конкурсу в Отдел инфекционной патологии и экспериментальной терапии института им. Н. Ф. Гамалея. Заведующим отделом был академик АМН СССР профессор Хуан Хуанович Планельес, личный врач знаменитой в прошлом испанской коммунистки — Долорес Ибаррури (1895–1989). Институт им. Гамалея находился в Щукино, недалеко от берега Москва-реки. Главное здание института и обширная территория (сад) были отгорожены от внешнего мира чугунной оградой и строгой системой пропусков и охранников. Сразу же создавалось впечатление государственных секретов, которыми насыщен институт. В главном здании, куда можно было войти тоже по специальному пропуску, была приемная директора института академика АМН СССР, профессора О. В. Барояна, его заместителей, а также всякие административные подразделения. Мой отдел находился в глубине территории. Сначала надо было пройти мимо вахтеров в пограничной форме с зелеными петличками и зелеными околышами фуражек, миновать живописный домик-кафетерий, потом пройти мимо конструктивистского здания научной библиотеки, где мне предстояло провести столько счастливых часов за чтением новейших американских или английских микробиологических журналов и монографий! Сразу за библиотекой аллея приводила к большому лабораторному корпусу, где размещался Отдел генетики микроорганизмов, которым заведовал Президент АМН СССР академик В. Д. Тимаков (1905–1977). Там же был Отдел эпидемиологии и Отдел вирусологии и иммунологии опухолей, в которых изучались проблемы диагностики и этиологии раковых заболеваний. Еще до недавнего времени здесь работал академик АМН СССР Л. А. Зильбер (1894–1966), который впервые предложил концепцию вирусогенетической этиологии рака. Он писал: «Размышляя над громадным материалом по поводу рака, я подумал, что инфекционный агент может не только уничтожать клетки, он может их изменять». Советская власть отмерила Л. A. Зильберу достаточно времени для размышлений, правда, не только в лабораториях, но и в лагерях ГУЛАГа, расположенных на Севере — в Коми АССР, где он провел 5 лет после ареста в 1936 году. Слева от этого научного корпуса находилось и длинное двухэтажное здание отдела природно-очаговых заболеваний. Сотрудники этого отдела каждую весну отправлялись в экспедиции в Сибирь, на Алтай, в Среднюю Азию или на Кавказ отлавливать комаров, клещей, слепней и других зловредных насекомых — переносчиков малярии, энцефалитов или прочих смертельных заболеваний.

Наш Отдел инфекционной патологии и экспериментальной терапии находился в одноэтажном продолговатом домике-бараке, приютившемся на самом конце институтской территории, среди вишневых деревьев, которые буйно цвели весной и щедро плодоносили в конце августа. Как будто бы специально отгородили иностранца Х. Х. Планельеса от частого общения с сотрудниками других лабораторий. Тематика отдела была довольно пестрой. В каждой лабораторной комнате сотрудники занимались самыми разнообразными исследованиями, не обязательно связанными с научными интересами шефа. Несомненно, Х. Х. Планельес представлял собой личность необычную в наших северных широтах. Смуглый, коренастый, неулыбчивый он сидел в своем кабинете, обложенный книгами и журналами, почти никогда не обходя лаборатории. Шутка, юмор, разговор о чем угодно, кроме фармакологии, патологии или микробиологии, были неуместны в его присутствии. Некоторые легенды о нем были рассказаны в первые же дни моего нахождения в отделе. Другие он сам рассказал мне, когда мы сблизились. Дело в том, что через полгода Х.Х. предложил мне стать ученым секретарем секции химиотерапии при московском обществе микробиологов. Х.Х. был председателем этой секции. Профессор Планельес приехал в СССР после окончания Гражданской войны в Испании (1936–1939). Он родился в городе Херес де ла Фронтера в состоятельной семье владельца фармацевтической компании. Молодой Хуан проявил необыкновенные способности равно как в медицине, так и в фармакологии, став в двадцать с небольшим лет испанским академиком. Случай перевернул всю его жизнь. В конце 1920-х — начале 1930-х ночью в его дом постучали. В дверях стояла молодая женщина, закутанная в черную шаль. На руках у нее был ребенок. «Доктор, спасите моего сына, он умирает!» «Почему же вы не обратились в больницу?» — спросил Х.Х. «Меня тотчас арестуют», — ответила незнакомка. Х.Х. пригласил ее войти, провел в свой кабинет, осмотрел ребенка. Это была тяжелая крупозная пневмония. Он назначил лечение и снабдил женщину лекарствами. В 1936 году он узнал из портретов, напечатанных в газетах, что незнакомка с больным ребенком была Долорес Ибаррури, вождь Республиканской Испании. Она не забыла о «чудесном докторе» и разыскала Х. Х. Планельеса. Он стал главным врачом Республиканской Армии. Встречался с Э. Хемингуэем, И. Эренбургом, М. Кольцовым и другими знаменитыми либералами, приехавшими поддержать антифашистов. К 1939 году Франко разгромил сторонников Республики. Гражданская война кончилась. Остатки республиканцев рассеялись по свету, стали эмигрантами. Родители Х.Х. остались в Испании. Дети осели в Швейцарии. Профессор Планельес, к тому времени член ЦК Испанской Компартии, вместе с Долорес Ибаррури и другими видными испанскими коммунистами нашли убежище в Советском Союзе. Х.Х. был вечно раздражен, недоволен собой и сотрудниками, чувствовал себя неуютно. Говорил Х.Х. невнятно, с ужасающим акцентом, зато писал по-русски превосходно. Однажды мы ехали с ним в метро от станции «Сокол» до станции «Краснопресненская», неподалеку от которой на площади Восстания помещался Институт усовершенствования врачей с кафедрой микробиологии, где проходили наши заседания. Внезапно Х.Х. показал мне на седовласого, бородатого старика-еврея и тихонько сказал: «Похож на старого испанца. А вы знаете, что почти во всех испанцах течет еврейская кровь. Даже у генерала Франко».

В научные интересы профессора Планельеса входило изучение побочных эффектов антибиотикотерапии. Наиболее многочисленная лаборатория в нашем отделе занималась эписомами, т. е. генетическими факторами, ответственными за устойчивость микробов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Эписомы находились вне хромосомной ДНК и могли независимо передаваться от одной бактерии к другой путем коньюгации (генетический материал перетекает по микроскопическим трубочкам-пилям), или при помощи бактериальных вирусов — бактериофагов. Этот способ передачи ДНК, находящейся в плазмидах, назывался трансдукцией. Другая лаборатория продолжала развивать теорию И. И. Мечникова (1845–1916) о фагоцитозе, приближаясь к современным представлениям о клеточном иммунитете не только против бактерий, но также вирусов и раковых клеток, особенно, при злокачественных заболеваниях крови: лейкемии и лимфозе. По горькому совпадению научная сотрудница, возглавлявшая эту лабораторию, умерла от острого лейкоза. Были еще лаборатории или группы, одна из которых занималась ролью микрофлоры в естественном иммунитете организма — направлении, которое тоже начал разрабатывать И. И. Мечников, работая в Институте Пастера в Париже. Смысл исследований этой лаборатории был в том, чтобы выявить микроорганизмы, обитающие в нормальных условиях на поверхности кожи или слизистых оболочек (глаз, рта, носоглотки, кишечника) и выделяющих вещества, способные убивать болезнетворных микробов. Милая дама весьма преклонных лет, возглавлявшая эту группу, работала когда-то с академиком Н. Ф. Гамалея (1859–1949). В шутку поговаривали, что в ее коллекции бактериальных культур хранятся штаммы кишечной палочки, представляющие микрофлору Н. Ф. Гамалея. Доказательством потенциальной полезности этих кишечных палочек и возможности их использования в народном здравоохранении являлось долголетие знаменитого микробиолога (90 лет жизни!). Были и другие сотрудники в отделе. Одна из них — вечная младшая сотрудница неопределенного возраста и неясного научного профиля время от времени по приказу Х. Х. Планельеса шла «помогать» сотрудникам то одной, то другой лаборатории, хотя никакой помощи никто не просил. После таких визитов эта сотрудница надолго запиралась в кабинете с шефом в его кабинете. Да, у Х.Х. была (не со времен ли гражданской войны в Испании?) привычка забегать на минутку в ту или иную лабораторию и «выдергивать» какого-нибудь сотрудника отдела для беседы за плотно закрытыми дверями. Эта настороженная встревоженность коллег была мне отвратительна, и вскоре я начал задумываться: правильно ли сделал, подав на конкурс в отдел, возглавляемый Х. Х. Планельесом.

Через несколько месяцев после начала работы в Институте им. Гамалея у нас родился сын Максим. Родился он 5 июня 1967 года как раз в день начала Шестидневной войны. Я был взбудоражен, счастлив, горд. Первым побуждением было назвать сына Израилем. Но постепенно я успокоился и согласился на прекрасное имя Максим, тем более, что это был крупный мальчик. Так совпало, что, вернувшись из родильного дома в институт, я оказался вместе с другими сотрудниками на митинге протеста против «агрессора Израиля и в защиту братских арабских стран, в частности Египта». Гневную речь произнес директор О. В. Бароян. Принята была резолюция протеста, за которую мы все голосовали. Для порядка О. В. Бароян спросил: «Кто против?» И тут на глазах у изумленных, восхищенных или возмущенных микробиологов, иммунологов и эпидемиологов взлетела рука: «Я против!» Через час этого храбреца отчислили из института.

Я работал с лаборанткой, которая училась на вечернем отделении Университета и при первой возможности усаживалась в укромный уголок, чтобы подготовиться к предстоящим занятиям. Она была приветливая девушка, дальняя родственница писателя K. M. Симонова, но по рассеянности или занятости иными мыслями могла поставить на пробирке номер другой культуры стафилококка или записать в таблице результат пенициллиназной активности одной культуры стафилококка в строчку, относившуюся к другой культуре. Приходилось дублировать ее опыты. К счастью, внезапно она получила работу на кафедре биологии Университета. Освободившееся место недолго пустовало. Институт был престижный, и выпускники биологических кафедр мечтали начать свою карьеру в науке с должности старшего лаборанта в Институте им. Гамалея. Я узнал позже, что в институте работали дети или внуки знаменитостей. Так в нашем отделе была аспирантка — дочь дважды лауреата Сталинской премии, поэта В. М. Гусева (1909–1944), автора бравурной комедии «Весна в Москве». В другом отделе был аспирант — внук А. И. Микояна (1905–1965). А в отделе эпидемиологии одной из ведущих сотрудниц директора Института О. В. Барояна была внучка К. И. Чуковского (1882–1969), дочь писателя Н. К. Чуковского (1904–1965). Мы ездили на одном автобусе с работы на работу и, случалось, беседовали о последних публикациях, научных и литературно-художественных. Однажды, это было в 1974 году после высылки за пределы СССР А. И. Солженицына, я спросил у нее (внучки К. И. Чуковского): «Как дела у вашей тетушки — Л. К. Чуковской?» В печати ее шельмовали за поддержку Солженицына. Моя коллега (внучка К. И. Чуковского) незамедлительно ответила: «Мы с этой семьей не общаемся».

С некоторыми из бывших аспирантов нашего отдела сохранилось научное сотрудничество в течение долгих лет. К примеру, Э. А. Вайнтрауб по окончании аспирантуры возглавила лабораторию микробиологии в Институте сердечно-сосудистой хирургии им. Бакулева. Мы изучали с Э.А. биологические свойства сотен культур стафилококка и обнаружили высокую степень корреляции между их способностью вызывать тяжелые поражения у больных и у экспериментальных животных, обладать устойчивостью к пенициллинам, даже синтетическим, и вырабатывать пенициллиназу (бета-лактамазу). Для этих массовых исследований мне удалось разработать надежный и быстрый экспресс-метод. Смысл этого метода заключался в том, что при росте колоний стафилококка на поверхности агара внеклеточный фермент пенициллиназа активно выделяется во внешнюю среду. Если в агар добавить пенициллин (субстрат), антибиотик будет разрушаться этим ферментом, образуя пенициллоиновую кислоту. Этот продукт распада пенициллина тотчас связывает йод, раствор которого наносился на поверхность агара, где растут колонии микробов. Связанный йод не может вызывать посинение крахмала (индикатора), заранее добавленного в агар. Словом, вокруг колоний стафилококков, продуцирующих пенициллиназу, образуются бесцветные зоны. Такие колонии преобладали среди культур стафилококка, выделенных из клинического материала. Более того, когда я, памятуя об экспериментах по смешанной инфекции, выполненных в Институте туберкулеза, заразил белых мышей одновременно пенициллиназопродуцирующими стафилококками и пенициллиназоотрицательными пневмококками и начал лечить животных пенициллином, патологический процесс резко усилился. Пенициллин разрушался беталактамазой стафилококков, блокируя лечебный эффект антибиотика, направленный против возбудителя пневмонии.

Казалось бы, нужно прибегнуть к лечению стафилококковых инфекций полусинтетическими пенициллинами (метициллин, оксациллин, нафциллин и др.) и цефалоспоринами, которые очень близки к пеницилллинам по химической структуре и способу действия на бактерий (цефалоспорин, цефалотин, цефазолин и др.). Так и было. Клиницисты начали активно применять эти препараты. Правда, в СССР из-за дороговизны (преимущественно, это были импортируемые антибиотики) применение их было ограниченным, особенно цефалоспоринов. Однако, вскоре наступило разочарование: стафилококковая инфекция, приглушенная вначале, вспыхивала с новой силой, заставляя применять другие классы импортируемых антибиотиков, химически далеких от пенициллинов. Эти антибиотики стоили дорого и были во много раз токсичнее, чем пенициллины и цефалоспорины.

Качественный и количественный методы определения пенициллиназной активности стафилококков показали, что взаимодействие новейших синтетических антибиотиков со стафилококками происходит двухфазно. В течение первой фазы активность этого микробного фермента в определенной мере подавляется полусинтетическими пенициллинами и цефалоспоринами. Однако, во второй фазе эти же самые препараты именно из-за структурной близости к пенициллину (наличие бета-лактамного кольца) стимулируют (индукция!) ген-регулятор, включенный в состав пенициллиназной плазмиды стафилококка, и приводят к еще большей выработке бета-лактамазы. Получался замкнутый круг, из которого меня мог вывести опытный специалист в биохимии микроорганизмов.

Это был профессор Василий Андреевич Благовещенский. Он заведовал лабораторией биохимии обмена веществ патогенных микроорганизмов, которая входила в отдел раневых инфекций. Руководил отделом Г. В. Выгодчиков. Тот самый ученый, который получил стафилококковый анатоксин. В этот же самый отдел входила лаборатория стафилококковых инфекций, с которой я был знаком со времен аспирантуры и в которой мечтал работать. Жизнь похожа скорее на путешествие со многими пересадками, нежели на прямой перелет из точки А в точку Б. Я продолжал работать у Х. Х. Планельеса и начал регулярные встречи-консультации с В. А. Благовещенским. Его лаборатория (несколько научных сотрудников, аспирантов и лаборантов) находилась на третьем этаже лабораторного корпуса, расположенного за пределами основной территории института им. Гамалея, метрах в ста от трамвайных путей, проложенных вдоль берега Москва-реки. Внизу был дикий пляж, куда молодые сотрудники института, аспиранты и лаборанты нелегально бегали позагорать и поплавать в жаркие летние дни московского лета.

Из отворявшихся дверей проходной, а летом и через открытые окна первого этажа корпуса, в котором работал В. А. Благовещенский, разносились концентрированные мясные ароматы. Это было одно из подразделений производственного отдела нашего института. Здесь готовились питательные среды для выращивания самых разнообразных микроорганизмов, с которыми работали лаборатории нашего и других микробиологических институтов. На втором этаже располагалась лаборатория стафилококковых инфекций и еще одно подразделение производственного отдела, где вырабатывали стафилококковый анатоксин, который рассылали по всей стране. И как символ единства науки и практики посредине находился кабинет Г. В. Выгодчикова, где он работал в дни, свободные от обязанностей по Академии медицинских наук. На дверях кабинета Г.В. висел плакатик: «Всегда занят — всегда свободен».

Биохимическая лаборатория В. А. Благовещенского, куда я впоследствии перешел, была на третьем этаже и граничила с лабораторией ботулизма. В. А. Благовещенский был полной противоположностью Х. Х. Планельеса, как, впрочем, физический и психологический тип русского человека отличается от испанца. В.А. был вальяжным, крупным, доброжелательным, улыбчивым профессором средних лет, выходцем из профессорской семьи, которая, в свою очередь, произошла из рода потомственных священников. Его отец, A. B. Благовещенский, в свои 87 лет продолжал работать в области биохимии растений. В.А. какими-то чертами характера напоминал Стиву Облонского: любил приятную беседу, хорошую обильную еду и не отказывал себе в удовольствии выпить рюмку-другую коньяка. Память у него была зеркальной чистоты, и это позволяло ему, не утруждая себя частыми походами в библиотеки, а только из бесед с сотрудниками или из выслушанных докладов на Ученом Совете находиться в курсе современной ему науки. Правда, он знал столь хорошо основы биохимии, что, просмотрев реферативные журналы и даже не читая оригинальных статей, мог представить себе полностью идею той или иной работы. Особенно славился он знаниями в области бактериальных ферментов (энзимов). Так что, взглянув на мои экспериментальные данные, он поставил точный диагноз: «Полусинтетические пенициллины и цефалоспорины суть конкурентные ингибиторы фермента бета-лактамазы». То есть, попадая в среду, где находится пенициллиназопродуцирующий стафилококк, они на первых порах присоединяются к субстрату — пенициллину и не дают бета-лактамазе разрушить антибиотик, который сохраняет способность убивать микробов. Но одновременно они обладают способностью стимулировать пенициллиназный ген. При этом выделяется de novo так много энзима, что все пенициллины, включая и полусинтетические, разрушаются до соединений, безвредных для Stap-hylococcus aureus. Надо искать другие бета-лактамы, которые не стимулируют пенициллиназные плазмиды, но конкурентно ингибируют пенициллиназу.

Препараты, которые могли обладать такими свойствами, были синтезированы в лаборатории профессора А. С. Хохлова (Институт химии природных соединений). Работу с этими препаратами я выполнял в лаборатории В. А. Благовещенского. Оказалось, что эти аналоги пенициллина, в особенности, сульфоксид феноксиметилпенициллина и сульфон бензилпенициллина способны были подавлять in vitro бета-лактамазу стафилококков, позволяя пенициллину тормозить развитие этих микроорганизмов. То есть пенициллину — самому первому и весьма активному (первоначально) антибиотику — возвращалась способность подавлять рост стафиликокков, несмотря на то, что они продуцировали бета-лактамазу. В то же время, даже в условиях этих экспериментов in vitro конкурентные ингибиторы не могли в полной мере препятствовать действию пенициллиназы стафилококка на бета-лактамное кольцо пенициллина.

Я задавался вопросом: «Как поведут себя соединения А. С. Хохлова в условиях экспериментальной стафилококковой инфекции — in vivo?» Очень часто неутешительные или малоутешительные результаты лабораторных опытов, поставленных в пробирках или на чашках Петри (in vitro), приводят ученых к преждевременному унынию или, наоборот, активность, выявленная in vitro, вселяет неоправданный оптимизм. В химиотерапии рака или инфекционных заболеваний прямая корреляция между опытами в пробирках или на экспериментальных животных наблюдается не всегда. Да это и понятно: в организме экспериментального животного препарат может разрушаться, прежде чем достигает своей цели. Или, напротив, действие лекарственного препарата может усиливаться, присоединяясь к факторам естественного иммунитета: фагоциты, антитела, лизоцим и др. Было замечено, что вид животного может влиять на результаты экспериментов. Точно также нельзя полностью экстраполировать в клинику данные, полученные в виварии на тех или иных видах экспериментальных животных. Я решил проверить препараты А. С. Хохлова в комбинации с пенициллином в отношении культур стафилококка, выделенных от тяжелых больных и устойчивых к пенициллину и обоим конкурентным ингибиторам. В опытах, которые проводились в виварии института, было использовано около 500 экспериментальных животных: белые мыши, белые крысы и золотистые хомячки. Мышей и крыс я заражал стафилококкками внутривенно, а хомячков — внутримышечно.

Виварий располагался в одноэтажном здании, вытянутом вдоль главной аллеи Института им. Гамалея. Клетки с мышами, крысами, хомячками и морскими свинками размещались внутри помещения. Клетки с кроликами, даже зимой, находились на открытом воздухе. В том же здании была фотолаборатория и лаборатория электронной микроскопии. Было у меня и постоянное содружество с гистологической лабораторией для того, чтобы наблюдать под микроскопом патологические изменения в органах и тканях животных. Работа была проведена огромная, а результаты оказались не такими блистательными, как ожидалось, в особенности, для химиков-органиков, которые с энтузиазмом синтезировали ингибиторы пени-циллиназы. С такими данными нельзя было идти в клинику и надеяться на излечение больных, зараженных Staphylococcus aureus. Однако во всяком эксперименте, пускай даже не столь удачном, как воображалось при его планировании, есть побочные данные, которые нередко отбрасываются. А иногда именно в них заключена истинная новизна. Так Александр Флеминг (Alexandre Fleming, 1881–1955) открыл пенициллин совершенно случайно. Он оставил чашку Петри с ростом культуры стафилококка на лабораторном столе. На поверхности питательной среды с колониями Staphylococcus aureus выросла плесень, которая растворила часть микробных колоний. Флеминг предположил, а потом доказал, что плесень выделяет антибиотик — пенициллин, за открытие которого его удостоили Нобелевской премии (1945).

При экспериментальной стафилококковой инфекции, вызванной внутривенным заражением белых мышей, возникает сепсис, и прежде всего поражаются почки. Во время вскрытия этих животных наблюдаются множественные абсцессы, окружающие и пронизывающие ткань почек. Для того, чтобы узнать, как много бета-лактамазы содержится в пораженных почках, ткань их измельчали в специальном гомогенизаторе и проводили химический анализ. Вполне понятно, что в качестве контроля мы исследовали гомогенаты почек здоровых, незараженных животных. К моему удивлению каждый раз удавалось обнаруживать, что в ткани здоровых почек тоже есть некий фермент, разрушающий специфический субстрат — пенициллин. Порывшись в научной литературе, я обнаружил статью, опубликованную в середине 50-х о наличии клеточной пенициллиназы в печени морских свинок. Более того, когда мы начали вводить здоровым белым мышам пенициллин или метициллин, пенициллиназа в ткани почек животных начинала нарастать. Этот биологический феномен имел двоякое значение для клиники. С одной стороны, организм быстрее освобождался от антибиотика. С другой стороны, действие пенициллинов на стафилококки, инфицировавшие организм, ослабляется не только за счет микробной бета-лактамазы, но и из-за действия фермента почечных клеток. А это значило, что доза пенициллинов должна рассчитываться с дополнительной поправкой. Так ли это? И не могут ли конкурентные ингибиторы, синтезированные химиком-органиком А. С. Хохловым подавлять активность не только микробной, но и тканевой пенициллиназы? Началась новая серия экспериментов. Животных на этот раз ничем не заражали. Одна группа мышей служила контролем. Другой — вводили пенициллин. Третьей — ингибитор бета-лактамазы. Мышам четвертой (главной) группы вводили пенициллин вместе с ингибитором бета-лактамазы — сульфоксид феноксиметилпенициллина. Оказалось, что наша гипотеза была правильной: ингибитор подавлял не только микробную пенициллиназу, но и фермент почечных клеток. Феномен был чрезвычайно интересным, и прежде всего, с общебиологической точки зрения, показывая единство живого — от бактерий до высших организмов.